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Jul 05, 2023

Calanus finmarchicus-Hydrolysat verbessert die Wachstumsleistung in Fütterungsversuchen mit jungen Wolfsbarschen und erhöht in Zellstudien das Wachstum der Skelettmuskulatur

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 12295 (2023) Diesen Artikel zitieren 226 Zugriffe auf 7 Altmetric Metrics-Details Die Welt wird von der Entwicklung neuartiger Futtermittelzutaten abhängig sein

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 12295 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Welt wird auf die Entwicklung neuartiger Futterzutaten aus erneuerbaren Quellen angewiesen sein, um ein nachhaltiges Wachstum der Aquakulturindustrie sicherzustellen. Zooplankton wie Calanus finmarchicus sind geeignete neue Rohstoffkandidaten, da sie optimale Nährstoffprofile für Wassertiere aufweisen und in großen Mengen nachhaltig geerntet werden können. Ziel dieser Studie war es zu untersuchen, ob ein Proteinhydrolysat von C. finmarchicus die Wachstumsleistung von Fischen beeinflussen kann. Die Wirkung der Aufnahme von Hydrolysaten in die Nahrung wurde in einem Fütterungsversuch mit jungen Wolfsbarschen (Dicentrarchus labrax) getestet, wobei Calanus-Hydrolysat (CH) mit kommerziell erhältlichen Hydrolysaten verglichen wurde. Die Diät mit CH-Einschluss führte am Ende des Versuchs zu einem gesteigerten Wachstum und einem deutlich höheren Körpergewicht als Hydrolysate von Sardinen und Thunfischen. Die beobachteten wachstumsfördernden Effekte wurden anhand eines In-vitro-Modells mit Skelettmuskelzellen von Atlantischem Lachs weiter untersucht. Durch Bioaktivitätsexperimente mit Muskelzellen, die in CH-haltigen Medien gezüchtet wurden, wurde festgestellt, dass niedermolekulare Fraktionen den größten positiven Effekt auf die Proliferation, Lebensfähigkeit und Expression muskelspezifischer Gene haben. Die Charakterisierung der wirksamsten Fraktion ergab eine Fülle kleiner Peptide sowie Aminosäuren und Meeresmetaboliten, die mit einem gesteigerten Muskelwachstum verbunden sind.

Schätzungen zufolge wird die Weltbevölkerung bis 2050 9,8 Milliarden Menschen erreichen1, was eine entsprechende Steigerung der globalen Nahrungsmittelproduktion erfordert. Die terrestrischen Nahrungsquellen nähern sich ihrer maximalen Nachhaltigkeitskapazität2, während nur 7 % aller weltweit konsumierten Proteine ​​aus Meeresfrüchten stammen3. Meeresfrüchte sind reich an verdaulichem Protein und essentiellen Aminosäuren, und Wassertiere haben im Vergleich zu Landtieren im Allgemeinen eine niedrige Futterverwertungsquote (FCR), was einen hohen Durchsatz an Nahrungsprotein ermöglicht4. Das Potenzial, die wachsende Bevölkerung mit einem größeren Anteil an Meeresfrüchten zu ernähren, liegt auf der Hand, insbesondere da die Nachfrage nach Nahrungsproteinquellen mit geringer Umweltbelastung in den kommenden Jahren voraussichtlich erheblich zunehmen wird5.

Angesichts der Unsicherheit und der derzeitigen Ausbeutung vieler globaler Fischereien wird die Aquakultur voraussichtlich in Zukunft die wichtigste Quelle für Meeresfrüchte sein3,5. Mit der Ausweitung der Aquakulturproduktion gehen Fragen nach deren Nachhaltigkeit einher, insbesondere im Hinblick auf die notwendigen Futterzutaten. Fischmehl war in der Aquakultur traditionell die bevorzugte Proteinquelle, aber seine saisonalen Schwankungen und Mengenbeschränkungen haben in der wachsenden Industrie zu einem Bedarf an zusätzlichen Proteinquellen geführt. Der Trend der letzten Jahre geht daher dahin, Futtermittel mit zunehmenden Mengen terrestrischer Pflanzenproteine ​​wie Soja, Mais und Raps zu formulieren6. Landpflanzenproteinquellen weisen im Vergleich zu Meeresproteinen suboptimale Aminosäureprofile auf, können ernährungshemmende Faktoren und Mykotoxine enthalten und weisen im Allgemeinen eine geringere Schmackhaftigkeit auf7,8,9. Diese Nachteile verringern nachweislich das Wachstum von Zuchtfischen und haben die Nachfrage nach neuen und nachhaltigen Proteinzutaten für die Aquakultur beflügelt. Von den vorgeschlagenen neuartigen Inhaltsstoffen werden niedrigtrophische Meeresressourcen wie Zooplankton aufgrund ihres erneuerbaren Biomassevolumens und ihrer Rolle als natürliche Nahrung im marinen Nahrungsnetz als attraktive und realisierbare Optionen angesehen. Eine Zooplanktonart mit Futteranwendungen ist Calanus finmarchicus, der auf der gesamten Nordhalbkugel vorkommt. Allein im Norwegischen Meer und angrenzenden Regionen wird die jährliche Biomasseproduktion von C. finmarchicus und eng verwandten Arten auf etwa 290 Millionen Tonnen geschätzt, was es zu einer der bedeutendsten erneuerbaren Ressourcen in der Region macht10. In einer aktuellen Übersicht über mesopelagische Arten als neue Meeresressourcen wurde festgestellt, dass die Biomasse von C. finmarchicus gut verstanden ist und dass der Bewirtschaftungsplan, der zehn kommerzielle Fanglizenzen für eine jährliche Gesamtquote von 254.000 Tonnen vergibt, seine biologische Nachhaltigkeit regelt11. Die enormen Mengen, kombiniert mit einer geeigneten Nährstoffzusammensetzung für Wassertiere12,13, machen C. finmarchicus zu einem besonders vielversprechenden Rohstoff für neuartige Futterzutaten für die Aquakultur.

Die enzymatische Proteinhydrolyse (EPH) ist eine Methode, die häufig zur industriellen Verarbeitung von Rohstoffen zu Futtermittelzutaten eingesetzt wird. EPH basiert auf Proteasen in Lebensmittelqualität, um proteinreiche Biomassen zu verdauen, was typischerweise zu Produkten führt, die aus einer wasserlöslichen Peptidfraktion, Lipiden und einer unlöslichen Feststofffraktion bestehen. Diese Technologie bietet eine schonende und umweltfreundliche Alternative zu Verarbeitungstechniken mit Chemikalien wie Lösungsmitteln und Säuren. Die nach EPH isolierte Proteinfraktion wird als Hydrolysat bezeichnet und kann als wichtiger Bestandteil in Futterformulierungen für Flossenfische dienen14. Zusätzlich zu ihren ernährungsphysiologischen und funktionellen Eigenschaften sind Hydrolysate potenzielle Quellen für spezifische bioaktive Peptide, die andere biologische Funktionen als ihre Vorläuferproteine ​​haben können. Diese bioaktiven Peptide können hormon- oder arzneimittelähnliche Eigenschaften aufweisen und zu den Wirkungsweisen, die sie ausüben können, gehören: anabol (wachstumsfördernd), antioxidativ, antimikrobiell, blutdrucksenkend, immunmodulatorisch und opioid15. Es hat sich gezeigt, dass die Einbeziehung von Hydrolysaten in die Ernährung von Wassertieren das Wachstum fördert und die Futtereffizienz erhöht16, und ein genauerer Blick auf bestimmte Fraktionen der Hydrolysate könnte helfen, einige dieser bioaktiven Wirkungen zu erklären. Früher veröffentlichte Studien mit EPH von C. finmarchicus konzentrierten sich darauf, wie die Ölphase am effektivsten extrahiert werden kann17. Es gibt daher wenig Wissen über die Proteinfraktion und wie sie die Wachstumsleistung von Fischen verbessern kann.

In der vorgestellten Studie bestand das übergeordnete Ziel darin, zu untersuchen, ob ein Hydrolysat aus C. finmarchicus das Wachstum der kommerziell wichtigen Fischarten Europäischer Wolfsbarsch (Dicentrarchus labrax) und Atlantischer Lachs (Salmo salar) verbessern kann. Der erste Teil bestand aus einem Fütterungsversuch, bei dem untersucht wurde, wie sich die Aufnahme von Calanus-Hydrolysat in die Nahrung auf die Wachstumsleistung des Europäischen Wolfsbarsches auswirkte, und es mit anderen kommerziellen Meereshydrolysaten verglichen wurde. Die im Fütterungsversuch mit Calanus-Hydrolysat beobachtete verbesserte Wachstumsleistung wurde im zweiten Teil weiter untersucht, wobei ein Modell von Skelettmuskelzellen aus Atlantischem Lachs verwendet wurde, um bioaktive Fraktionen des Hydrolysats zu identifizieren, die mit einem erhöhten Skelettmuskelwachstum verbunden sind.

Die Aufnahme eines neuartigen Proteinhydrolysats aus dem marinen Zooplankter C. finmarchicus in die Nahrung führte zu einer verbesserten Wachstumsleistung des Europäischen Wolfsbarsches in einem Fütterungsversuch, bei dem marine Proteinhydrolysate als funktionelle Futterzutaten verglichen wurden. Die beobachteten wachstumsfördernden Eigenschaften von Calanushydrolysat (CH) wurden mithilfe eines In-vitro-Zellmodells für Skelettmuskeln weiter untersucht. Untersuchungen, wie sich die Ergänzung von CH im Zellkulturmedium in Zellstudien auf die Lebensfähigkeit, Proliferation und Genexpression auswirkte, gefolgt von der Fraktionierung von CH, führten zur Identifizierung und Charakterisierung der bioaktivsten Fraktion, die mit einem erhöhten Muskelzellwachstum verbunden ist. Eine Zusammenfassung des Arbeitsablaufs ist in Abb. 1 dargestellt.

Schematische Darstellung der Methoden zur Untersuchung der wachstumsfördernden Eigenschaften eines Hydrolysats aus Calanus finmarchicus. (A) Fütterungsversuch mit europäischem Wolfsbarsch. (B) Bioaktivitätsstudien an Calanushydrolysat. CCH: Rohes Kalanushydrolysat; DCH: entsalztes Kalanushydrolysat; F1-F6: Fraktion 1–6; SEC: Größenausschlusschromatographie; NMR: Kernspinresonanzspektroskopie.

Der Fütterungsversuch zielte darauf ab, die wachstumsfördernden Wirkungen von Kalanushydrolysat (CH) aus der Nahrung mit kommerziell erhältlichen Meeresproteinhydrolysaten von Sardine (SDH), Thunfisch (TH) und Lachs (SH) zu vergleichen. Moderate Einschlüsse (5–10 %) mariner Proteinhydrolysate zur Verbesserung der Wachstumsleistung von Fischen sind gut dokumentiert14. Marine Hydrolysate können auch die Nährwerteigenschaften verbessern, um die Futteraufnahme zu stimulieren18, und die Aufnahme von Nährstoffen erhöhen und das Wachstum fördern, wie bei Starterfutter für Atlantischen Lachs beobachtet19. Ein Benchmarking von CH mit ähnlichen funktionellen Inhaltsstoffen, also der Einsatz von Diäten mit kommerziellen Meereshydrolysaten als Kontrollen, würde wohl aussagekräftigere Ergebnisse liefern als der Vergleich mit einer Standard-Fischmehl-Kontrolldiät.

Junge Wolfsbarsche mit einem Ausgangsgewicht von 8,9 ± 0,4 g akzeptierten alle Diäten vollständig. Bei ähnlichem Ausgangsgewicht für alle Gruppen, die die unterschiedlichen Diäten erhielten, und gleichen Varianzen (Tabelle S7.1–S7.3. in den ergänzenden Daten) war eine einfache ANOVA anwendbar, um die Parameter zu verschiedenen Zeitpunkten zu vergleichen. Es wurden keine signifikanten Auswirkungen auf das Überleben, die Gesamtkörperzusammensetzung oder die Futteraufnahme beobachtet (Tabellen S3–S6 in den ergänzenden Daten). Allerdings führte die Einbeziehung von CH nach 84 Tagen zu einem deutlich höheren Körpergewicht als SDH (p = 0,003) und TH (p = 0,047) (Abb. 2A) und zeigte im gesamten Versuch eine erhöhte Wachstumsrate im Vergleich zu SDH (p = 0,002) (Abb . 2B). Die Wachstumsleistung hängt eng mit der Fähigkeit zusammen, Nährstoffe in Körpergewicht umzuwandeln, und die Beziehung zwischen erhöhtem Körpergewicht und aufgenommenem Protein ist das Protein-Effizienz-Verhältnis (PER), das zur Bewertung der Qualität von Nahrungsproteinbestandteilen verwendet werden kann. Die Fische, die CH über die Nahrung erhielten, zeigten während des gesamten Versuchs einen höheren PER (Abb. 2C) mit deutlich höheren Endergebnissen im Vergleich zu den kommerziellen Hydrolysaten SDH (p = 0,002), TH (p = 0,011) und SH (p = 0,037). Die Futterumwandlungsrate (FCR) misst die Effizienz, mit der Fische ihren Input (Futter) in den gewünschten Output (Körpergewicht) umwandeln. Dabei wird das gesamte Futter berücksichtigt, nicht nur das Protein. Am Ende des Versuchs hatten Futtermittel, die die drei kommerziellen Hydrolysate enthielten, FCRs im Bereich von 1,28 bis 1,33, während CH einen FCR von 1,22 aufwies, der deutlich niedriger war als die von SDH und TH (Abb. 2D). Diese FCR-Werte stimmen gut mit denen überein, die in ähnlichen Studien mit Nahrungshydrolysaten für europäischen Wolfsbarsch gefunden wurden20.

Benchmarking mariner Hydrolysate als Futterzutaten für Wachstumsleistung und Futterverwertung beim Europäischen Wolfsbarsch (Dicentrarchus labrax). (A) Körpergewicht: Die Fische wurden für jeden Tank gruppenweise gewogen. (B) Spezifische Wachstumsrate (SGR): [(ln-Endgewicht – ln-Anfangsgewicht)/Anzahl der Tage] × 100. (C) Proteineffizienzverhältnis (PER): Nassgewichtszunahme/Rohproteinaufnahme. (D) Futterverwertungsverhältnis (FCR): Rohfutteraufnahme/Gewichtszunahme. CH: Calanus-Hydrolysat; SDH: Sardinenhydrolysat; TH: Thunfischhydrolysat; SH: Lachshydrolysat. Balken sind Mittelwerte ± Standardabweichung (n = 3). Unterschiedliche Buchstaben bezeichnen statistische Unterschiede (P < 0,05).

Die Ergebnisse des Wachstumsleistungsversuchs unterstreichen das Potenzial von CH als funktioneller Inhaltsstoff in Fischfuttermitteln und zeigen, dass die Einbeziehung von CH in die Nahrung das Wachstum verbessern und die Gesamtproteinretention und Futterverwertung steigern kann.

Nach unserem besten Wissen ist dies die erste veröffentlichte Studie, in der ein Proteinhydrolysat von C. finmarchicus in einem Fütterungsversuch verwendet wurde. Daher sind nur wenige direkte Vergleiche möglich. Eine Studie zeigte jedoch, dass die Ergänzung von C. finmarchicus-Mehl in der Ernährung von jungem Atlantischen Heilbutt (Hippoglossus hippoglossus) die Wachstumsrate und die Effizienz der Nährstoffverwertung erheblich verbessern könnte21. Die Mahlzeit wurde verarbeitet, um ihren Proteingehalt zu erhöhen, enthielt aber im Gegensatz zu optimalen Proteinhydrolysaten auch erhebliche Mengen an Lipiden. Eine weitere Studie mit Zooplanktonprotein zeigte, dass die Aufnahme von Mehl aus antarktischem Krill (Euphausia superba) in der Nahrung für Europäischen Wolfsbarsch die Wachstumsleistung und Futtereffizienz steigerte22. Die offensichtlichen Vorteile der Aufnahme von Zooplankton wie C. finmarchicus und antarktischem Krill in die Ernährung von Fischen sollten nicht überraschen, da Zooplankton für die meisten Fischarten natürliche Nahrung darstellt, insbesondere in frühen Lebensstadien. Allerdings ist wenig darüber bekannt, warum Zooplankton und seine Produkte das Wachstum wesentlich fördern, und die anschließenden Experimente untersuchen diese Eigenschaften detaillierter.

In Anbetracht der Tatsache, dass die Futtermittel isostickstoffhaltig, isolipidisch und isoenergetisch waren (Tabelle 3, Materialien und Methoden) und es zwischen ihnen keine signifikanten Unterschiede in der Futteraufnahme gab, würden alle beobachteten Unterschiede in der Wachstumsleistung ausschließlich auf der Zusammensetzung und den Eigenschaften der Futtermittel beruhen einzelne Hydrolysate. Zusammensetzung und Eigenschaften mariner Proteinhydrolysate können je nach Rohstoffquelle, den zur Hydrolyse verwendeten Enzymen sowie den Bedingungen und der Dauer der Hydrolyse unterschiedlich sein18. In mehreren Studien wurden Hinweise darauf gefunden, dass bestimmte Hydrolysatfraktionen die Wachstumsleistung von Fischen auf vielfältige Weise beeinflussen können23,24.

Das erste In-vitro-Bioaktivitätsexperiment wurde durchgeführt, um anhand eines Modells mit primären Skelettmuskelzellen von Atlantischem Lachs zu bestimmen, ob der natürliche Mineralstoffgehalt von CH das Wachstum der Skelettmuskulatur beeinflusst. Europäischer Wolfsbarsch und Atlantischer Lachs sind beide Knochenfischarten und teilen die grundlegenden Ereignisse der Myogenese25. Die primären Skelettmuskelzellen des Lachses sind etablierte Modelle für Bioaktivitätsexperimente zur Untersuchung des Muskelwachstums und seiner Mechanismen26,27,28,29,30.

Dem Wachstumsmedium wurden drei Konzentrationen von rohem und entsalztem CH zugesetzt, um zu testen, ob eine Ergänzung davon die Lebensfähigkeit, Proliferation und Zytotoxizität der Muskelzellen beeinflussen könnte. Die Zellstoffwechselaktivität stieg signifikant an, wenn das Zellkulturmedium mit entsalztem CH in Konzentrationen von 1 mg/ml und 0,1 mg/ml ergänzt wurde (Abb. 3A), verglichen mit Zellen, die mit Kontrollmedium (ohne zugesetzte Hydrolysate) behandelt wurden. Die Zellproliferation wurde nicht beeinträchtigt, außer wenn die Zellen mit Kulturmedium behandelt wurden, das rohes CH in einer Menge von 0,1 mg/ml enthielt (Abb. 3B). Nur die höchste Konzentration an rohem CH (1 mg/ml), die den Zellkulturmedien zugesetzt wurde, induzierte erhöhte Laktatdehydrogenase (LDH)-Spiegel in den Zellen, was sich negativ auf das Zellüberleben auswirken könnte (Abb. 3C).

Lebensfähigkeit (A), Proliferation (B) und Zytotoxizität (C) von Muskelzellen des Atlantischen Lachses, kultiviert in Wachstumsmedien, ergänzt mit drei Konzentrationen (0,01, 0,1 oder 1 mg/ml CH im Wachstumsmedium) rohem oder entsalztem Calanushydrolysat. CH: Calanus-Hydrolysat; RFU: Relative Fluoreszenzeinheiten; LDH: Laktatdehydrogenase; CTL: Kontrolle (kein zugesetztes Hydrolysat zum Zellkultur-Wachstumsmedium). Die Ergebnisse werden mit Box- (25. bis 75. Perzentilen mit Linie am Medianwert) und Whisker-Diagrammen (Min. bis Max.) (n = 4) dargestellt. Sterne (*) kennzeichnen statistisch signifikante Unterschiede zur Kontrolle (P < 0,05).

Das erste Bioaktivitätsexperiment zeigte, dass die entsalzten Hydrolysate in Zellstudien eine bessere Leistung erbrachten (Abb. 3). Eine mögliche Erklärung ist, dass kultivierte Zellen anfällig für Mineralgehalte sind, die über ihren natürlichen Konzentrationen liegen, da hohe Mineralkonzentrationen einen osmotischen Effekt hervorrufen können, bei dem die Zellen Wasser verlieren und schrumpfen31. Während kultivierte Zellen negativ auf erhöhte Mineralstoffgehalte reagieren können, gilt das Gegenteil für die meisten Wassertiere, insbesondere solche marinen Ursprungs, die erhebliche Mengen an Mikronährstoffen wie Mineralien in ihrer Ernährung benötigen32. Dennoch deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die positiven Auswirkungen von CH auf das Muskelwachstum auf seine inhärenten Peptide und nicht auf seinen Mineralstoffgehalt zurückzuführen sind. Daher wurde das entsalzte CH für die verbleibenden In-vitro-Experimente ausgewählt.

Als nächsten Schritt zur weiteren Eingrenzung der Liste potenziell bioaktiver Verbindungen in CH wurde das entsalzte CH fraktioniert, um zu untersuchen, wie unterschiedlich große Peptidfraktionen das Muskelwachstum beeinflussen. CH wurde mittels Größenausschlusschromatographie (SEC) abgetrennt und ergab sechs Fraktionen mit durchschnittlichen Molekulargewichten von >742 Da (F1), 742 Da (F2), 527 Da (F3), 407 Da (F4), 316 Da (F5). und 260 Da (F6). Die Muskelzellen wurden dann in Wachstumsmedien kultiviert, die jede der Peptidfraktionen enthielten, um ihren individuellen Einfluss zu messen, während die Kontrollzellen in Wachstumsmedium ohne Ergänzung von Peptidfraktionen kultiviert wurden. F3, F4 und F6 waren mit der höchsten Lebensfähigkeit der Zellen verbunden, deutlich höher als die Kontrolle und die Fraktionen F1 und F2, während F5 einen mittleren Effekt zeigte (Abb. 4A). Ebenso induzierte das mit F6 ergänzte Zellkulturmedium die höchste Proliferationskapazität, deutlich höher als die Kontrolle und F5 (Abb. 4B). Insgesamt zeigten die Ergebnisse, dass Fraktionen mit niedrigerem Molekulargewicht das Muskelwachstum positiver beeinflussten als Fraktionen mit höherem Molekulargewicht. Dies steht im Einklang mit früheren Studien, die wachstumsfördernde Wirkungen von Peptiden mit kleinem Molekulargewicht zeigten33. Bakke et al.23 zeigten, dass kleine Peptide und Aminosäuren, die während der Hydrolyse gebildet werden, die Absorption von Molekülen im Darmtrakt erleichtern können, indem sie die Expression von Peptidtransportern erhöhen. Rashidia et al.34 fanden heraus, dass niedermolekulare Fraktionen aus dem Hydrolysat von Garnelenabfällen die Wachstumsleistung von Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss) verbessern können, und Zheng et al.24 wiesen auf einen positiven Effekt auf das Wachstum und die Futterverwertung bei jungen Steinbutten (Scophthalmus maximus) hin. durch die Verwendung niedermolekularer Verbindungen aus Fischproteinhydrolysat. Auch niedermolekulare Fraktionen aus Proteinhydrolysaten erwiesen sich in Studien an primären Muskelzellen von Säugetieren als bioaktiver35,36.

Lebensfähigkeit (A) und proliferative Aktivität (B) von Muskelzellen des Atlantischen Lachses, kultiviert in Wachstumsmedien, ergänzt mit sechs nach Größe getrennten Fraktionen entsalzten CH (0,1 mg/ml). RFU: Relative Fluoreszenzeinheiten; CTL: Kontrolle; F1-F6: CH-Fraktionen 1–6. Die Ergebnisse werden mit Box- (25. bis 75. Perzentilen mit Linie am Medianwert) und Whisker-Diagrammen (Min. bis Max.) (n = 5) dargestellt. Kleinbuchstaben (a, b, c) bezeichnen statistisch signifikante Unterschiede (P < 0,05).

Für die Genexpressionsanalyse wurden die beiden vielversprechendsten Fraktionen aus den Tests auf Lebensfähigkeit (F4 und F6) und Proliferation (F6) ausgewählt. Die Expression von Genen, die mit dem Muskelwachstum verbunden sind, wurde für Zellen analysiert, die in mit F4 und F6 ergänzten Medien kultiviert wurden, um den Einfluss dieser wirksamen Fraktionen detaillierter zu untersuchen. Die Proliferation und Differenzierung von Myoblasten zu mehrkernigen Myotubes erfordert die Expression von Genen, die für muskelregulierende Faktoren wie den myogenen Faktor 5 (Myf5) und das Myoblastenbestimmungsprotein 1a (MyoD1a) kodieren37,38. Myf5 und MyoD1a sind frühe Marker, die für die Spezifizierung von Zellen in die Muskellinie verantwortlich sind25. Die muskelregulierenden Faktoren sind für die Transkription mehrerer muskelspezifischer Gene von wesentlicher Bedeutung, was zu einer erhöhten Expression struktureller Muskelproteine ​​wie der schweren Kette von Myosin (MHC) führt. In differenzierenden Muskelzellen werden frühe Marker herunterreguliert, während späte Marker wie strukturelle Muskelproteine ​​hochreguliert werden25. In Wachstumsmedien mit F4 kultivierte Muskelzellen hatten keinen Einfluss auf die Genexpression von myf5 oder myod1a, wohingegen F6 eine Herunterregulierung beider Gene induzierte (Abb. 5A und B). Obwohl die Ergebnisse knapp unter der statistischen Signifikanzgrenze lagen, gab es einen Trend zu einer höheren Expression von mhc (Abb. 5C), wobei F6 die höchste Hochregulierung aufwies (p = 0,0518). Eine Herunterregulierung der frühen Muskelmarker myf5 und myod1a, gleichzeitig mit einer tendenziellen Hochregulierung von mhc, könnte darauf hindeuten, dass CH-Peptidfraktionen die Muskelzellen positiv beeinflussten, indem sie deren Differenzierungsrate erhöhten. Die beobachteten positiven Effekte auf die Differenzierung von Muskelzellen in vitro könnten durch die Zusammensetzung bestimmter kleiner Peptide und Aminosäuren in F4 und F6 erklärt werden. Es wurde zuvor festgestellt, dass die Ergänzung von in vitro kultivierten Muskelzellen des Atlantischen Lachses mit den Aminosäuren Glutamat und Arginin die Genexpression sowohl früher als auch später muskelspezifischer Marker beeinflusst, darunter Myogenin, Myf5, MyoD1a, Myf6 und die leichte Myosinkette27.

Relative Genexpression der Muskelregulationsfaktoren myf5 (A) und myod1a (B) und des Muskelstrukturproteins mhc (C) nach 72-stündiger Inkubation mit Zellkulturmedien, ergänzt mit verschiedenen CH-Fraktionen (F4 und F6). myf5: Myogener Faktor 5; myod1A: Myoblasten-Bestimmungsprotein 1A; mhc: Schwere Myosinkette; Relative Genexpression (RGE); CTL: Kontrolle, F4; CH-Fraktion 4; F6: CH-Fraktion F6. Die Ergebnisse werden als Boxplots dargestellt (Min. bis Max. mit Linie am Mittelwert, n = 3). Unterschiedliche Buchstaben bezeichnen statistische Unterschiede (P < 0,05).

Die beiden CH-Fraktionen mit niedrigem Molekulargewicht, die den größten Einfluss auf die Lebensfähigkeit (F4 und F6) und die Proliferation (F6) der Muskelzellen des Atlantischen Lachses zeigten, wurden weiter analysiert, um die Molekulargewichtsverteilung der Peptide zu untersuchen. Im Vergleich zu rohem CH stellte sich heraus, dass sowohl F4 als auch F6 relativ geringe Mengen an früh eluierenden großen Proteinen und große Mengen an spät eluierenden Peptiden mit kleinerem Molekulargewicht darstellen (Abb. 6). Die durchschnittlichen Molekulargewichte der Peptide in den Fraktionen wurden mit 407 bzw. 260 g/mol für F4 bzw. F6 berechnet, was ungefähr Peptiden mit einer durchschnittlichen Länge von 3,6 bzw. 2,3 Aminosäureresten entspricht (berechnet unter Verwendung eines gewichteten durchschnittlichen Molekulargewichts von 113 g/mol für einzelne Aminosäuren). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die wachstumsfördernden Wirkungen, die im Fütterungsversuch und in In-vitro-Studien beobachtet wurden, möglicherweise auf niedermolekulare Peptide in CH zurückzuführen sind, von denen bekannt ist, dass sie von Peptidtransportern im Darm effizient aufgenommen werden39 und die Wachstumsleistung verbessern34.

Molekulargewichtsverteilung von rohem CH und den Fraktionen F4 und F6, ermittelt mittels Größenausschlusschromatographie mit UV-Überwachung (214 nm).

F6 wurde als die bioaktivste Fraktion in Bezug auf Lebensfähigkeit, Proliferation und Genexpression in vitro kultivierter Muskelzellen identifiziert und mit 1H-NMR-Spektroskopie weiter charakterisiert (Abb. 7). Vorläufige Zuordnungen der Protonen-NMR-Peaks wurden anhand veröffentlichter chemischer Verschiebungswerte für eng verwandte Proben durchgeführt40,41,42. Zusätzlich zu den charakteristischen Signalen, die Seitenketten aromatischer und aliphatischer Aminosäuren zugeordnet wurden, wurden signifikant große Signale häufigen marinen Metaboliten wie Trimethylamin-N-oxid (TMAO) und Dimethylglycin (DMG) zugeordnet. Besonders interessant war die Häufigkeit von DMG in Kombination mit den verzweigtkettigen Aminosäuren (BCAAs). Es hat sich gezeigt, dass die Ergänzung von DMG-Salz in der Nahrung die Wachstumsleistung und die Funktion der Skelettmuskulatur bei Landtieren verbessert43,44 und die Aufnahme von Nahrungs-BCAAs in Aquafuttermittel zum Wachstum und zur Fleischqualität beiträgt45. Glutamat und Arginin, die oben genannten Aminosäuren, die nachweislich die Expression muskelspezifischer Gene erhöhen27, wurden ebenfalls als Teil mehrerer häufiger Peaks in der Fraktion identifiziert. Laktat ist ein weiterer Metabolit, der in der Fraktion identifiziert wurde und mit der Wachstumsstimulation in Verbindung gebracht wird. Berichten zufolge spielt es eine Rolle bei der belastungsinduzierten menschlichen Wachstumshormonreaktion46, stimuliert die Hypertrophie und Regeneration der Skelettmuskulatur von Mäusen47 und stimuliert das Wachstum, wenn es der Nahrung von Seesaiblingen (Salvelinus alpinus) hinzugefügt wird48.

1H-NMR-Spektren von CH-F6 mit vorläufigen Zuordnungen basierend auf zuvor gemeldeten Werten der chemischen Verschiebung. Zuweisungen wurden für die häufig vorkommenden Peaks durchgeführt und nur Peaks, die für ein bestimmtes Molekül diagnostisch waren, wurden zugeordnet. Nicht zugewiesene Peaks sind mit „*“ gekennzeichnet.

Die Einbeziehung von Calanus-Hydrolysat (CH) in die Nahrung in einem Fütterungsversuch mit jungen europäischen Wolfsbarschen führte zu einer höheren Wachstumsleistung und Futtereffizienz im Vergleich zu anderen kommerziellen Meereshydrolysaten und unterstreicht das Potenzial von CH als funktioneller Inhaltsstoff in Fischfutter. In der folgenden In-vitro-Studie wurden niedermolekulare Fraktionen von CH mit einer erhöhten Lebensfähigkeit und proliferativen Aktivität in einem Lachs-Skelettmuskelzellmodell in Verbindung gebracht. Darüber hinaus zeigte ein Genexpressionsexperiment eine Herunterregulierung früher Muskelmarker und einen Trend zu einer stärkeren Expression eines strukturellen Muskelmarkers, was auf einen positiven Effekt auf die Muskeldifferenzierung hinweisen könnte. Die Charakterisierung der bioaktivsten Fraktion mittels 1H-NMR ergab, dass sie kleine Peptide und wichtige Aminosäuren, aber auch Metaboliten enthielt, die zuvor mit einem gesteigerten Muskelwachstum in Zusammenhang gebracht wurden. Weitere Studien sind erforderlich, um den direkten Beitrag solcher Metaboliten zu den beobachteten wachstumsfördernden Wirkungen zu quantifizieren. Nach Kenntnis des Autors ist die vorliegende Studie die erste, die das vielversprechende Potenzial von CH als Futterzutat mit spezifischen wachstumsfördernden Bestandteilen zeigt.

Das Rohmaterial von Calanus finmarchicus wurde von Calanus AS (Tromsø, Norwegen) geerntet und zu Calanus-Hydrolysat (CH) verarbeitet, und die kommerziellen Hydrolysate aus Lachs (SH), Sardine (SDH) und Thunfisch (TH) wurden von SPAROS gekauft und geliefert , Lda. (Olhão, Portugal). Calanus- und Lachshydrolysate wurden in flüssiger Form verwendet, während es sich bei den Hydrolysaten von Sardine und Thunfisch um trockene Pulver handelte. Die Nährstoffzusammensetzung der Testhydrolysate ist in Tabelle 1 dargestellt.

Die vier experimentellen Diäten im Versuch wurden mit geringen Mengen an Fischmehl und Weizengluten formuliert und durch die marinen Hydrolysat-Testprodukte (Kalanus, Lachs, Sardine und Thunfisch) und zusätzliche pflanzliche Proteine ​​ausgeglichen (Tabelle 2). Um alle Diäten hinsichtlich der Proteinversorgung gleichwertig zu machen, lag der Einschlussgehalt der Hydrolysate aufgrund ihres unterschiedlichen Rohproteingehalts zwischen 2,95 % und 4,20 % (Trockenbasis) (Tabelle 1). Insgesamt waren die formulierten Diäten isostickhaltig (48 % Rohprotein), isolipidisch (16 % Rohfett) und isoenergetisch (21,9 MJ/kg).

Bei SPAROS wurden Diäten durch Extrusion hergestellt. Alle Pulverbestandteile wurden gemäß der Zielformulierung in einem Doppelhelixmischer (Modell RM90, MAINCA, Spanien) gemischt und in einer Mikropulverisierer-Hammermühle (Modell SH1, Hosokawa-Alpine, Deutschland) gemahlen (unter 250 µm). Testhydrolysate aus Calanus und Lachs wurden, da sie in flüssiger Form vorliegen, nach dem Mahlen in die Futtermaische eingearbeitet. Diäten (Pelletgrößen: 1,5 und 2,0 mm) wurden mit einem Doppelschneckenextruder (Modell BC45, Clextral, Frankreich) mit einem Schneckendurchmesser von 55,5 mm hergestellt. Die Extrusionsbedingungen waren wie folgt: Fördermenge (44 kg/h), Schneckengeschwindigkeit (142 U/min), Wasserzugabe (ca. 290 ml/min), Temperatur Zylinder 1 (24–29 °C), Temperatur Zylinder 3 (105–107). °C). Extrudierte Pellets wurden in einem vibrierenden Wirbelschichttrockner (Modell DR100, TGC Extrusion, Frankreich) getrocknet. Nach dem Abkühlen wurden Öle nach der Extrusion durch Vakuumbeschichtung hinzugefügt (Modell PG-10VCLAB, Dinnissen, Niederlande). Die fertigen Pellets wurden in versiegelten Plastikeimern verpackt und zum Forschungsstandort transportiert, wo sie bei Raumtemperatur in einer kühlen und gut belüfteten Umgebung gelagert wurden. Von jeder Diät wurden Proben zur analytischen Charakterisierung entnommen (Tabelle 3, Tabellen S1–S2 in den ergänzenden Daten). Die Analyse vollständiger Futtermittel wurde mit analytischen Duplikaten durchgeführt und folgte dabei der von AOAC49 für die meisten Analysen beschriebenen Methodik: Trockenmasse nach 24-stündigem Trocknen bei 105 °C; Gesamtasche durch Verbrennung (550 °C, 6 h) in einem Muffelofen (Nabertherm L9/11/B170, Deutschland); Rohprotein (N × 6,25) durch eine Flash-Verbrennungstechnik, gefolgt von gaschromatographischer Trennung und Wärmeleitfähigkeitserkennung mit einem Leco N-Analysator (Modell FP-528, Leco Corporation, USA); Rohlipid durch Petroletherextraktion (40–60 °C) unter Verwendung eines Soxtherm-Systems (Multistat SX PC, Gerhardt, Deutschland); Bruttoenergie in einem adiabatischen Bombenkalorimeter (Werke C2000, IKA, Deutschland). Die Aminosäuren wurden nach 24-stündiger Hydrolyse in 6 M HCL bei 108 °C in mit Stickstoff gespülten Fläschchen unter Verwendung eines Waters Pico-Tag-Umkehrphasen-HPLC-Systems mit Norleucin als internem Standard bestimmt. Die resultierenden Chromatogramme wurden mit der Breeze-Software (Waters, USA) analysiert. Tryptophan wurde aufgrund seiner Zerstörung durch Säurehydrolyse nicht analysiert. Mineralien und Fettsäuren wurden in einem zertifizierten Labor (Eurofins Anàlisis Alimentario SL, Spanien) gemäß ISO 27.085:2009 mit der ICP-AES-Methode50 für Mineralien und mittels Gaschromatographie und Flammenionisationsdetektion (GC-FID) für Fettsäuren analysiert .

Der Fütterungsversuch wurde in den Versuchsanlagen von SPAROS (Olhão, Portugal) durchgeführt, die von Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (Landwirtschaftsministerium, Portugal) für Experimente mit Wasserarten registriert sind. Das Versuchsprotokoll wurde vom Tierschutzausschuss – Órgão Responsável pelo Bem-Estar Animal (ORBEA) von SPAROS (Versuchsreferenz: CALBASS) genehmigt. Die Experimente wurden von FELASA-zertifizierten Wissenschaftlern und technischem Personal unter vollständiger Einhaltung der ARRIVE-Richtlinien und der europäischen (Richtlinie 2010/63/EU) und portugiesischen (Decreto-Lei Nr. 113/2013, 7. August) Gesetzgebung zum Schutz von Tieren durchgeführt wissenschaftliche Zwecke.

Der Versuch wurde in den experimentellen Forschungseinrichtungen von SPAROS (Olhão, Portugal) mit europäischem Wolfsbarsch (Dicentrarchus labrax) durchgeführt, der von der Estação Piloto de Piscicultura de Olhão (EPPO) vom portugiesischen Institut für Meer und Atmosphäre (IPMA) bezogen wurde. Ungefähr 650 Fische wurden von einem ordnungsgemäß autorisierten Transportunternehmen in die SPAROS-Versuchseinrichtungen gebracht, und im Zusammenhang mit dem Transport wurden keine nennenswerten Todesfälle oder pathologischen Anzeichen festgestellt. Die Fische wurden drei Wochen lang in Sanitärquarantäne gehalten und vor Beginn des Versuchs mit einem handelsüblichen Standardfutter gefüttert.

Insgesamt wurden 360 Fische auf 12 Tanks (30 Fische pro Tank) verteilt, wobei jeweils drei Tanks für die Versuchsfuttermittel vorgesehen waren. Es wurden vier experimentelle Diäten formuliert (Tabelle 2), die jeweils ein Meereshydrolysat (Kalanus, Sardine, Thunfisch oder Lachs) enthielten. Das mittlere anfängliche Körpergewicht der Fische betrug 8,9 ± 0,4 g und sie wurden 84 Tage lang mit den experimentellen Diäten gefüttert. Die subquadratischen PVC-Tanks enthielten 90 l Wasser und befanden sich in Innenräumen, wurden mit durchströmtem Salzwasser versorgt (Durchflussrate: 4,6 l/min) und photoperiodischen Bedingungen von 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit ausgesetzt. Die durchschnittliche Wassertemperatur während des Versuchs betrug 23,0 ± 1,4 °C, der Salzgehalt 35,8 ± 0,5 ‰, der Gehalt an gelöstem Sauerstoff im Wasser wurde über 5,3 mg/L gehalten und der Ammoniakgehalt lag unter der Nachweisgrenze.

Die Fische wurden bis zur visuellen Sättigung in vier täglichen Mahlzeiten um 09:00, 12:00, 15:00 und 18:00 Uhr von Hand gefüttert. Es wurde größte Sorgfalt darauf verwendet, Futterverschwendung zu vermeiden und eine genaue Quantifizierung der Aufnahme zu ermöglichen. Leicht betäubte (20 ml/L AQUI-S, Neuseeland) Fische wurden zu Beginn, am 30. Tag, am 67. Tag und schließlich am 84. Tag in Gruppen gewogen. Die Futteraufnahme wurde berechnet, das Überleben wurde täglich überwacht und die Wachstumsleistung wurde aufgezeichnet an den oben genannten Tagen. Das Futterumwandlungsverhältnis (FCR), das Proteineffizienzverhältnis (PER) und die spezifische Wachstumsrate (SGR) wurden nach Abschluss des Versuchs anhand dieser Formeln berechnet (n = 3):

FCR: Rohfutteraufnahme/Gewichtszunahme.

PER: Nassgewichtszunahme/Rohproteinaufnahme.

SGR: (Ln-Endkörpergewicht – Ln-Anfangskörpergewicht) × 100/Tage.

Rohes Kalanushydrolysat (CCH, 46 % Trockenmasse) wurde gefriergetrocknet, um ein hellbraunes Pulver zu ergeben. Um die Peptide aus dem rohen Hydrolysat weiter zu verfeinern, wurde CCH 1:1 in Milli-Q-Wasser verdünnt, unter Verwendung eines Millex-Spritzenfilters mit einer PVDF-Membran (Porengröße 0,45 μm, Merk Millipore, Burlington, MA, USA) filtriert und mit Semi entsalzt -präparative Chromatographie. Die Fraktionierungen wurden mit einem Dionex Ultimate 3000-Gerät (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) durchgeführt, das mit einer quaternären Pumpe und einem automatischen Thermometer zur Probenahme sowie einem UV-Detektor mit variabler Wellenlänge ausgestattet war. Die Entsalzung wurde unter Verwendung einer Umkehrphasensäule Thermo Betasil C18, 250 × 10 mm Innendurchmesser, 10 μm Partikelgröße (Thermo Scientific) durchgeführt. Als mobile Phase wurden H2O (Lösungsmittel A) und Acetonitril (Lösungsmittel B) verwendet, beide angesäuert mit 0,1 % Ameisensäure. Das folgende Elutionsprofil wurde bei einer Flussrate von 2 ml/min verwendet: 0 min, 0 % B; 10,0 Min., 0 % B; 35,0 Min., 100 % B; 41,0 Min., 100 % B; 51,0 Min., 0 % B. Die entsalzten Calanushydrolysat (DCH)-Fraktionen wurden zwischen 5,2 Min. und 35,0 Min. Retentionszeit gesammelt und gefriergetrocknet, um ein hellgelbes Pulver zu ergeben. Sowohl gefriergetrocknetes CCH als auch DCH wurden direkt für das erste Screening in den Zellkulturtests verwendet. DCH wurde mittels Größenausschlusschromatographie (SEC) weiter fraktioniert. Die Fraktionierung basierend auf dem Molekulargewicht wurde unter Verwendung des gleichen oben beschriebenen Systems und einer präparativen Yarra SEC-2000-Säule, 300 × 21,1 mm ID, 5 µm Partikelgröße (Phenomenex, Torrence, CA, USA) durchgeführt. Die mobile Phase bestand aus einer Mischung aus Acetonitril und hochreinem Wasser im Verhältnis 30:70 (v/v) mit 0,1 % Ameisensäure. Als Injektionslösung wurde 1:1 in Milli-Q-Wasser verdünntes CCH verwendet, das mit einem Millex-Spritzenfilter mit einer PVDF-Membran gefiltert wurde. Die chromatographische Trennung wurde mittels isokratischer Elution mit 30 % Acetonitril (0,1 % Ameisensäure) bei einer Flussrate von 3 ml/min von 0 bis 55 min durchgeführt. Es folgte ein 3-minütiges Waschen mit NaH2PO4 (0,10 M) und eine anschließende 20-minütige Säulenäquilibrierung mit 30 % Acetonitril. Von insgesamt 15 Injektionen von 500 μl wurden Fraktionen gesammelt. Insgesamt wurden sechs Fraktionen CH-F1 bis CH-F6 gesammelt, gepoolt und vor der Analyse mit Zellkulturen gefriergetrocknet. Die aus der Zellkulturstudie identifizierten aktiven Fraktionen (F4 und F6) wurden unter Verwendung des Protokolls von Wubshet et al.51 auf ihre Molekulargewichtsverteilung analysiert.

Primäre Skelettmuskelzellen des Atlantischen Lachses wurden gemäß Østbye und Ytteborg 28 isoliert. Die isolierten Muskelzellen wurden in T25-Zellflaschen (Muskelgewebe von acht 5-cm-Lachsen pro T25-Zellflasche) mit Wachstumsmedium ausgesät, das 10 % fötales Rinderserum (FBS) enthielt. , 0,01 M HEPES (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA), 10 ml/L Antibiotikum-Antimykotikum (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA), in L-15-Medium GlutaMAX (Invitrogen, Carlsbad, USA). Die Zellen wurden 2 Tage lang bei 13 °C ohne CO2 inkubiert. Die Zellen wurden dann trypsiniert und für Lebensfähigkeits- oder Proliferationstests auf Platten mit 96 Vertiefungen oder für die Genexpressionsanalyse auf Platten mit 6 Vertiefungen übertragen. Nach einem Tag Inkubation bei 13 °C ohne CO2 wurde den Zellen Wachstumsmedium zugesetzt, das 2 % FBS und verschiedene Konzentrationen an Calanushydrolysat enthielt. Die Zellen wurden 72 Stunden lang mit Hydrolysaten inkubiert, bevor sie für die verschiedenen Analysen geerntet wurden.

Es wurden zwei separate Zellversuche durchgeführt, um die Wirkung von Calanushydrolysat auf das Skelettmuskelwachstum von Atlantischem Lachs zu untersuchen. Im ersten Zellversuch wurden drei Konzentrationen (1,00, 0,10 und 0,01 mg/ml, pH 7) roher und entsalzter Calanus-Hydrolysate auf Lebensfähigkeit, Toxizität und Proliferation von Zellen getestet. Im zweiten Zellversuch wurden sechs unterschiedlich große, getrennte Fraktionen (F1-F6) des entsalzten Hydrolysats (0,10 mg/ml) durch Lebensfähigkeits- und Proliferationstests untersucht. Für die Genexpressionsanalyse wurden nur F4 und F6 einbezogen.

Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch Messung der ATP-Produktion mit CelltiterGlo (Promega Corporation, Madison, WI, USA), der potenziellen Toxizität der Hydrolysate mit dem Cytotoxicity Detection Kit (LDH) (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) und der Proliferation der Zellen bewertet unter Verwendung des CyQUANT Cell Proliferation Assay (Molecular Probes, Oregon, USA) gemäß den Protokollen des Herstellers.

Das RNeasy-Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) wurde verwendet, um Gesamt-RNA aus den Muskelzellen gemäß dem Protokoll des Herstellers zu isolieren. Alle Proben wurden mit DNase I (Invitrogen, Carlsbad, USA) behandelt, um genomische DNA zu entfernen. Die Konzentration und Reinheit der RNA wurden mit dem NanoDrop 1000-Spektrophotometer (NanoDrop Technologies, USA) bewertet. Taqman-Reverse-Transkriptase-Reagenzien (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) wurden verwendet, um cDNA aus 500 ng RNA in einem Reaktionsvolumen von 20 μl unter den folgenden Bedingungen zu synthetisieren: 25 °C für 10 Minuten, 37 °C für 30 Minuten, und 95 °C für 5 Min. Das qPCR-Reaktionsgemisch bestand aus 4 μl verdünnter (1:10) cDNA, 1 μl Vorwärts- und Rückwärtsprimer mit einer Endkonzentration von 0,5 μM (Tabelle S8 in den ergänzenden Daten) und 5 μl PowerUp SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster). Stadt, Kalifornien, Vereinigte Staaten). Für jedes Primerpaar wurde eine Standardkurve einbezogen, um die Primereffizienz zu bewerten, und eine Schmelzkurvenanalyse wurde einbezogen, um die Amplifikation nur eines Produkts zu verifizieren. Alle Proben wurden parallel analysiert und es wurden Kontrollen ohne Vorlage und ohne Enzym einbezogen. Die qPCR-Reaktion wurde auf einem QuantStudio 5-Gerät (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 50 °C für 20 s, 95 °C für 20 s, 40 Zyklen mit 95 °C für 1 s und 60 °C C für 20 s, 95 °C für 1 s und 60 °C für 20 s, 95 °C für 1 s. RefFinder52 wurde verwendet, um das stabilste Referenzgen von ef1a, rpol2 und etif3 zu bewerten. Das relative Genexpressionsniveau wurde gemäß der ΔΔCt-Methode mit Effizienzkorrektur53 unter Verwendung von rpol2 als Referenzgen berechnet.

Die 1H-NMR-Analyse der vielversprechenden Fraktion (F6) wurde mit einem Bruker Ascend-System (1H-Betriebsfrequenz 400 MHz) durchgeführt, das mit einem Probenwechsler und einem 5-mm-Probenkopf mit inverser Gradientendreifachresonanz (Bruker Biospin) ausgestattet war. Die NMR-Probe wurde durch Auflösen von ca. 5 mg CH-F6 in 0,7 ml D2O mit 0,05 Gew.-% % TMSP-d4-Natriumsalz als interner Standard. IconNMR (Version 4.2, Bruker Biospin) wurde zur Steuerung der automatischen Erfassung von NMR-Daten (Temperaturausgleich auf 300 K, Optimierung der Sperrparameter, Gradientenanpassung und Einstellung der Empfängerverstärkung) verwendet und die Verarbeitung der NMR-Daten erfolgte mit Topspin (Version 3.0, Bruker Biospin). Die eindimensionalen 1H-NMR-Spektren wurden mit 30°-Pulsen, 4 s Aufnahmezeit, 1 s Relaxationsverzögerung und 32 K-Datenpunkten aufgenommen. Die Datenpunkte wurden vor der Fourier-Transformation auf 64 K mit Nullen aufgefüllt und mit einer Exponentialfunktion (Linienverbreiterung = 0,3 Hz) multipliziert.

Die Daten zu den Bewertungskriterien des Fütterungsversuchs werden als Mittelwert ± Standardabweichung mit n = 3 Wiederholungen dargestellt. Daten aus den Bioaktivitätsstudien mit Skelettmuskelzellen werden mit Boxplots (n = 3–5 Wiederholungen) dargestellt, um die Verteilung dieser spezifischen Daten besser darzustellen. Alle Daten waren normalverteilt mit gleichen Varianzen (Tabelle S7.1–S7.3 in den Zusatzdaten). Das Ausgangsgewicht der Fische in den verschiedenen Futtergruppen war ähnlich, was eine einseitige Varianzanalyse (ANOVA) zum Vergleich der Wachstumsparameter zu verschiedenen Zeitpunkten ermöglichte. Für alle Bioaktivitätsstudien mit Skelettmuskelzellen wurde auch eine einfaktorielle ANOVA durchgeführt. Gegebenenfalls wurden die Mittelwerte mit der Tukey-Methode verglichen. Die statistische Signifikanz wurde auf einem Wahrscheinlichkeitsniveau von 0,05 getestet. Alle statistischen Tests wurden mit GraphPad Prism (Version 9.2.0) durchgeführt.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Genexpressionsdatensätze sind im DataverseNO-Repository für offene Forschungsdaten verfügbar (https://doi.org/10.18710/MRVDNS), alle anderen Daten finden Sie im ergänzenden Material oder im Autor auf Anfrage.

Verzweigtkettige Aminosäure

Calanus-Hydrolysat

Rohes Calanushydrolysat

Kontrolle

Entsalztes Calanus-Hydrolysat

Dimethylglycin

Enzymatische Proteinhydrolyse

Fraktion 1–6 des Calanus-Hydrolysats

Futterverwertungsverhältnis

Schwere Kette von Myosin

Myogener Faktor 5

Myoblastenbestimmung Protein 1a

Kernresonanzspektroskopie

Proteineffizienzverhältnis

Relative Fluoreszenzeinheiten

Lachshydrolysat

Sardinenhydrolysat

Größenausschlusschromatographie

Spezifische Wachstumsrate

Thunfischhydrolysat

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Diese Studie wurde vom norwegischen Forschungsratsprojekt „Vorteile von Calanus-Proteinprodukten in Futtermitteln und Lebensmitteln“ (Fördernummer 312136), TailoTides (Fördernummer 320086) und vom MABIT-Projekt „Identifizierung und Charakterisierung wachstumsfördernder Peptide aus Calanus“ unterstützt ® Hydrolysat“ (Fördernummer UB0077). Die Veröffentlichungskosten für diesen Artikel wurden durch einen Zuschuss aus dem Publikationsfonds der UiT The Arctic University of Norway finanziert. Besonderer Dank geht an Vibeke Voldvik und Nina Solberg von Nofima sowie an die Ingenieure von SPAROS für ihren Beitrag zur Laborarbeit, zum Umgang mit Fisch, zur Probenahme und zu Analysen.

Open-Access-Finanzierung bereitgestellt von UiT The Arctic University of Norway (einschließlich Universitätsklinikum Nordnorwegen).

Das norwegische College für Fischereiwissenschaften, UIT – The Arctic University of Norway, Postfach 6050, 9037, Tromsø, Norwegen

Isak Bøgwald und Karl-Erik Eilertsen

Calanus AS, Postfach 808, 9258, Tromsø, Norwegen

Isak Bøgwald und Alice Marie Pedersen

Nofima AS – Norwegisches Institut für Lebensmittel-, Fischerei- und Aquakulturforschung, Osloveien 1, 1430, Ås, Norwegen

Tone-Kari K. Østbye, Sissel Beate Rønning & Sileshi Gizachew Wubshet

SPAROS Lda, Marim Business Area, Lot C, 8700-221, Olhão, Portugal

Jorge Dias

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Jeder Autor hat zu verschiedenen Teilen der Konzeption und Gestaltung der Studie beigetragen; IB/JD/AMP/KEE für den Fütterungsversuch und IB/SW/SBR/TKØ/AMP/KEE für die Bioaktivitätsstudien. JD führte zusammen mit Ingenieuren von SPAROS den Fütterungsversuch durch und TKØ/SW/SBR führte zusammen mit Ingenieuren von Nofima die Bioaktivitätslaborstudien durch. IB/SW/TKØ verfasste den ersten Entwurf des Manuskripts, und alle Autoren trugen zur Überprüfung, Bearbeitung und Fertigstellung des Manuskripts bei.

Korrespondenz mit Isak Bøgwald.

Isak Bøgwald ist Industriedoktorand an der UiT und Calanus AS, und Alice Marie Pedersen hat eine Stelle bei Calanus AS inne. Tone-Kari K. Østbye, Sissel Beate Rønning, Jorge Dias, Karl-Erik Eilertsen und Sileshi Gizachew Wubshet erklären, dass keine kommerziellen oder finanziellen Beziehungen bestehen, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten. Calanus AS erwarb Fördermittel und SPAROS und Nofima führten praktische Durchführungen des Fütterungsversuchs bzw. der Bioaktivitätslaborstudien durch.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Bøgwald, I., Østbye, TK.K., Pedersen, AM et al. Calanus finmarchicus-Hydrolysat verbessert die Wachstumsleistung in Fütterungsversuchen mit jungen Wolfsbarschen und erhöht in Zellstudien das Wachstum der Skelettmuskulatur. Sci Rep 13, 12295 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38970-5

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Eingegangen: 14. April 2023

Angenommen: 18. Juli 2023

Veröffentlicht: 29. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38970-5

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